小鼠ELISA試劑盒采用雙抗體夾心法，單抗包被于酶標(biāo)板上，標(biāo)本和標(biāo)準(zhǔn)品中的小鼠試劑會(huì)與單抗結(jié)合，游離的成分被洗去。加入生物素化的抗小鼠試劑抗體和辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的親和素，生物素與親和素特異性結(jié)合;抗小鼠試劑抗體與結(jié)合在單抗上的小鼠試劑結(jié)合而形成免疫復(fù)合物，游離的成分被洗去。加入顯色底物，若反應(yīng)孔中有小鼠試劑，辣根過(guò)氧化物酶會(huì)使無(wú)色的顯色劑現(xiàn)藍(lán)色，加終止液變黃。在450 nm處測(cè)OD值，小鼠試劑濃度與OD450值之間呈正比，可通過(guò)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線求出標(biāo)本中小鼠試劑的濃度。
小鼠ELISA試劑盒中一般有兩次抗原抗體反應(yīng)，即加標(biāo)本和加酶結(jié)合物后。抗原抗體反應(yīng)的完成需要有一定的溫度和時(shí)間，這一保溫過(guò)程稱為溫育，有人稱之為孵育，在ELISA試劑盒中似不恰當(dāng)。
ELISA試劑盒屬固相免疫測(cè)定，抗原、抗體的結(jié)合只在固相表面上發(fā)生。以抗體包被的夾心法為例，加入板孔中的標(biāo)本，其中的抗原并不是都有均等的和固相抗結(jié)合的機(jī)會(huì)，只有最貼近孔壁的一層溶液中的抗原直接與抗體接觸。這是一個(gè)逐步平衡的過(guò)程，因此需經(jīng)擴(kuò)散才能達(dá)到反應(yīng)的終點(diǎn)。在其后加入的酶標(biāo)記抗體與固相抗原的結(jié)合也同樣如此。這就是為什么ELISA試劑盒反應(yīng)總是需要一定時(shí)間的溫育。
溫育常采用的溫度有43℃、37℃、室溫和4℃等。37℃是實(shí)驗(yàn)室中常用的保溫溫度，也是大多數(shù)抗原抗體結(jié)合的合適溫度。在建立ELISA試劑盒方法作反應(yīng)動(dòng)力學(xué)研究時(shí)，實(shí)驗(yàn)表明，兩次抗原抗體反應(yīng)一般在37℃經(jīng)1-2小時(shí)，產(chǎn)物的生成可達(dá)頂值。為加速反應(yīng)，可提高反應(yīng)的溫度，有些試驗(yàn)在43℃進(jìn)行，但不宜采用更高的溫度。抗原抗體反應(yīng)4℃更為*，在放射免疫測(cè)定中多使反應(yīng)在冰箱中過(guò)夜，以形成最多的沉淀。但因所需時(shí)間太長(zhǎng)，在ELISA試劑盒中一般不予采用。
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更新時(shí)間：2021-04-13
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